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干細胞應用
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羊膜干細胞

全世界每年約有千萬以上人群遭受各種形式的創傷,數百萬人因疾病康復過程重要器官發生纖維化而導致功能喪失。對于只采用藥物療法而不能得以恢復的嚴重損傷,不得不依靠人工臟器或臟器移植來解決。而器官移植仍然是一種有損傷和有代價的治療方法,并且由于受到倫理以及機體免疫排斥等方面的限制很難滿足臨床救治的需要。因此,利用工程學和生命科學的原理和技術,在體外預先構建一個有生命的種植體或體外裝置,用于修復組織缺損,替代器官的部分或全部功能,具有極為重要的意義。利用組織工程學技術能制造出含有特定活性的細胞群落,將后者直接移植或者播種于可降解材料上,不但有良好的生物相容性,同時還具有生長潛力,在臨床上具有廣泛的應用前景。所謂再生醫學就是以利用人類的自然治愈能力,使受到巨大創傷的機體組織或器官獲得自己再生能力為目的的醫學,包括組織工程、細胞和細胞因子治療、基因治療、微生態治療等。再生醫學研究的核心問題在于移植細胞源(種子細胞)的篩選和培養、移植材料和移植途徑的選擇,以及一系列與其相關的試驗學方法。目前在再生醫學領域研究得最多的是干細胞,而干細胞涉及的倫理道德還缺乏相應的規范,臨床廣泛應用尚需時日。近年來研究發現,羊膜組織細胞具有干細胞樣特性,可以誘導分化成各種組織細胞,容易獲得,而又不引起任何倫理爭議。羊膜組織細胞的這些優勢使其作為干細胞的具有廣闊前景的替代物。

1 羊膜組織細胞的生物學特性

羊膜中的羊膜上皮細胞(hAEC)、人羊膜間充質基質細胞(hAMSC)具有干細胞特征,研究及應用羊膜及羊膜來源細胞將具有廣泛的前景。

1.1 羊膜上皮細胞

羊膜上皮細胞(hAEC)HLA-DR 表達缺失,不表達HLA-A、B、C,羊膜組織不能刺激人外周血T 細胞活化及CD8+T 細胞亞群表面分子CD69 產生活化表達,免疫源性極低,體內細胞移植不引發免疫排斥。羊膜上皮細胞能產生各種生長因子如表皮細胞生長因子(EGF)、轉移生長因子β(TGF-β)、肝細胞生長因子(HGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及白細胞介素-10(IL-10)等,其中50多種可檢測到。這些細胞因子可能通過單獨或網狀途徑加速嗜中性粒細胞的程序性死亡,然后影響膠原酶的產生及其相關功能,從而減輕炎癥;在體外實驗中發現,羊膜上皮細胞可能通過分泌一種可溶性因子抑制先天免疫和獲得性免疫;還能抑制纖維化和新生血管形成,可以減少血管化的肉芽組織。

hAECs表達人類胚胎干細胞的相關蛋白,包括:POU 區域、class5、轉錄因子1、Nanog 同源異形盒、SRY-box 2 和SSEA-4。通過對細胞表型、mRNA 表達、免疫細胞化學和超微結構進行分析,在體外可以誘導分化為心肌、肌肉、骨、脂肪、胰腺、肝細胞、神經元和星形膠質細胞。

近年來多項研究表明,hAECs中存在有神經元前體細胞或干細胞,有合成釋放生物活性物質和神經營養因子的功能;在培養基內的羊膜細胞處于多分化狀態,表達神經外胚層、中胚層和內胚層的標志蛋白,在神經誘導培養基中培養的羊膜細胞表現為神經細胞的形態并且神經特異性基因表達上調。培養的羊膜上皮細胞合成和釋放活化素(Activin)和頭蛋白(Noggin)。ActivinA 可以誘導初始反應基因(primary response gene) Nogginm RNA 的表達, 提示羊膜上皮細胞內存在Activin 信號路徑,人類羊膜組織中有可能包含有早期發育的神經元。對人類和哺乳類動物的羊膜細胞生物學特性進行深入研究后發現,培養人羊膜上皮細胞中有RC1、Vimentin、A2B5、NFP、MAP2、GFAP 等免疫組織化學染色陽性細胞,提示羊膜上皮細胞中存在多潛能的神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的前體細胞。而后又在組織學、蛋白質和mRNA 水平證實了少突膠質細胞特異性標記物髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、環核苷酸磷酸二脂酶CNPase、蛋白脂質蛋白(proteolipid protein,PLP)的表達。研究發現,人羊膜組織中存在Nestin/GFAP 雙陽性細胞,Vimentin 和PSA-NCAM 陽性細胞, 以及Nestin/GFAP 雙陽性細胞;這些雙陽性細胞表達Vimentin 和Nestin 兩種神經干細胞的標志物,也表達神經元的標志物NSE 和β-微血管蛋白(β-tubulin);大部分細胞表達多巴胺能神經元的標志物TH,少數細胞表達星型膠質細胞的標志物GFAP。

1.2 人羊膜間質細胞

人羊膜間充質基質細胞(hAMSC)能夠產生前列腺素,并表達神經祖細胞和心肌細胞的一些標志。從羊膜中培養、擴增出hAMSC,經免疫表型鑒定與骨髓來源的MSC相似,且其比骨髓來源的MSCs具有更強的擴增能力。hAMSC在體外可以誘導分化為脂肪細胞和軟骨細胞,證實了其具有分化為成熟的中胚層細胞的能力。采用酶消化法從羊膜中分離、培養出間質干細胞,并在體外誘導向神經元樣細胞分化,證實了其分化為成熟的外胚層細胞的能力。將hAMSC在體外通過血管內皮生長因子(VEGF)的誘導作用,可成功地分化成血管內皮細胞,這對血管移植組織工程的發展將會有很大促進作用。在適當的培養條件下,從羊膜中分離出間質細胞經體外擴增后,顯示出有分化成脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞和神經細胞的潛能,經RT - PCR技術分析人羊膜細胞具有低免疫原性。

2 羊膜干細胞的應用

2.1 在中樞神經損傷修復中應用

2.1 在中樞神經損傷修復中應用
在治療神經系統疾病方面,hAEC有特別的潛能。由于hAEC具有干細胞的特征,表達神經系統和神經膠質標志物以及神經系統特異蛋白,產生和分泌神經遞質、多種神經營養因子,如腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養因子-3(NT-3)等,促進神經元的存活及其軸突生長,因此,可用其來進行細胞治療,在神經系統疾病中的應用有著極為重要的意義。

1)缺血性腦損傷:羊膜上皮細胞具有改善神經元功能與活性作用。將人羊膜細胞移植到SD大鼠腦損傷模型的腦內,人羊膜細胞可以在腦內存活至移植后4 周,并且能表達神經元特異性抗原MAP2,移植組動物后肢功能較對照組明顯改善,提示人羊膜細胞移植治療能有效改善神經功能。培養的羊膜上皮細胞中存在有神經元和神經干細胞表面標記Nestin、MAP2 的陽性細胞,同時表達Nestin mRNA;將純化后的神經元干細胞進行腦缺血模型的腦內細胞移植, 移植細胞可以遷移到缺血部位,與腦缺血部位相應的神經元成活。羊膜上皮細胞能促進體外培養的神經干細胞的分化,且主要向神經元分化,并促進神經元初級突起的生長。提示羊膜上皮細胞為神經干細胞提供促進其分化及存活適宜的微環境。

2)脊髓損傷:羊膜上皮細胞具有修復神經系統損傷的作用。利用體外培養標記的人羊膜上皮細胞移植治療猴脊髓損傷,通過15~60d 觀察,移植部位有成活的人羊膜上皮細胞存在,并且宿主脊髓中有與羊膜上皮細胞同樣標記物的神經元和軸突,治療組脊髓損傷側后肢運動功能恢復明顯優于對照組。治療組移植物內可見AchE、TH 陽性神經纖維和GFAP 陽性的神經膠質細胞,移植物內有熒光金染色。將人羊膜細胞移植入脊髓損傷大鼠模型體內,采用Basso、Beatlie、Bresnahan(BBB)運動功能評分并將組織取材進行形態學觀察,移植組從術后第2 周開始后肢功能迅速恢復,到第4 周達平臺期,觀察結束時移植組BBB 評分明顯好于對照組。在移植后第2 周和8 周都能見到羊膜細胞,但是隨著時間延長細胞數量逐漸減少。其原因可能是:羊膜細胞最大限度的保存了神經元,使得神經環路的完整性強于非移植組;促進中間神經元的發育、再生,建立上下環路部分聯系; 羊膜細胞提供的營養因子促進了脊根神經節的發育,增強了本體感覺環路所介導的反射形成。

3)帕金森?。≒D):緩解帕金森病的臨床癥狀。PD 是常見于老年人,是一種神經退行性病變,以腦的蒼白球及黑質的多巴胺(DA)進行性減少為特征,目前尚缺乏有效的治療措施。研究表明,羊膜細胞能夠合成并產生DA,分子水平研究證實羊膜上皮細胞有酪氨酸羥化酶(TH)的mRNA 和蛋白質表達,在培養羊膜上皮細胞中,約10%的細胞酪氨酸羥化酶免疫組織化學染色陽性。酪氨酸羥化酶陽性細胞體內移植治療大鼠帕金森病模型的實驗表明,其不僅可以緩解帕金森病的臨床癥狀,而且腦內移植細胞可以存活并具有產生DA 的功能。資料顯示,用人羊膜上皮細胞移植治療帕金森病大鼠,治療組PD 大鼠的旋轉行為改善明顯達14 周,BDNF 基因修飾的hAECs 組能使恢復時間提前。hAECs 可以作為一種治療PD 的供體細胞。還有人將人羊膜細胞移植入MPTP 所致的大鼠PD 模型腦內紋狀體, 檢測MPTP 對黑質內細胞的毒性、移植細胞的存活情況和內源性神經細胞再生,以及紋狀體內BDNF 和GDNF 水平。結果顯示人羊膜細胞表達神經前體細胞的標志并且能分化成神經細胞、DA 能神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞,TH 陽性神經細胞在對照組的黑質內明顯減少,在移植治療組明顯增加,免疫組化顯示移植的細胞在PD 大鼠腦內存活,側腦室下區的BrdU 陽性細胞和紋狀體內的神經營養因子水平明顯增加。

2.2 外周神經損傷修復中的應用:

應用羊膜來源間充質干細胞移植治療SD 大鼠坐骨神經損傷, 步態分析結果顯示移植治療組明顯優于對照組, 移植治療組的肌肉復合動作電位的波幅百分比為43%, 對照組為29%,動作電位傳導潛伏期分別為1.7ms 和2.5ms,移植組治療效果優于對照組。

2.3 肝臟再生修復中的應用

肝細胞移植已經成為肝臟疾病治療的新方法。然而,缺乏合適的肝細胞為制約該技術發展的瓶頸。hAEC表達一些肝細胞基因和功能,經過有效和高效的方法誘導完全的肝細胞分化,hAEC將成為肝細胞移植的有用的細胞來源。hAEC向肝細胞分化的臨床前研究令人鼓舞。在體外,已經分化出表達很多肝功能的細胞,包括轉錄因子HNF3γ、C/EBPα、HNF1和HNF4α等;分化的肝細胞基因,包括Alb、α1抗胰蛋白酶(A1AT)、葡萄糖6-磷酸酶等;以及藥物代謝基因;移植后hAEC能在肝內成功植入,存活6個月以上。應用Western blot技術,在小鼠血清中能檢測到人A1AT;腹腔接受人羊膜移植的SCID小鼠,在其血清和腹水中可檢測到人白蛋白;這些結果表明hAEC在小鼠體內執行重要的肝臟功能。hAEC定向分化的肝細胞最少表達30多個已知在成熟肝細胞表達的基因,提示移植hAEC來源的肝細胞可能為一種肝臟疾病有效的治療方法。這些表達的重要肝細胞基因為A1AT、OTC、CPS-I和UGT1A1。這些基因突變引起的代謝性肝臟疾病現在已可被肝移植矯正。hAEC移植可能為這些代謝缺陷患者提供一種新的可能治療方法。

2.4 缺血性心臟疾病治療中的應用

心肌缺血、梗死是終末期閉塞性血管性疾病的嚴重后果?,F在的治療措施是不充分的、姑息性的。細胞心肌成形術是治療心肌細胞缺血性損傷的主要方法,但是由于心肌細胞不能有效地分化,從而通常會導致心力衰竭。因此,人們致力于尋找用于細胞心肌成形術的合適細胞。研究發現,將hAMCs移植入心肌梗死的鼠心臟后,hAMCs 在瘢痕組織中存活至少2 個月并且能分化成心肌細胞。將hAMSC與新生大鼠心臟組織共培養,hAMSC可整合入心臟組織并分化為心肌細胞樣細胞。由透明質酸、丁酸和維甲酸組成的混合酯可促進人羊絨膜來源的細胞向心/血管細胞分化。以維甲酸處理的hAMSC和hCMSC表達心臟和內皮細胞標志物如vWF,可增強梗死大鼠心臟的心肌修復。hAMSC和hCMSC移植物可增高梗死側心臟的毛細血管密度,正?;笫夜δ?,減少瘢痕形成。移植混合酯預處理的hAMSC和hCMSC更進一步增高毛細血管密度,產生表達人vWF的細胞,減小梗死面積。有些植入的經維甲酸預處理的hAMSC和hCMSC連接蛋白43和心肌鈣蛋白Ⅰ也為陽性。這些改善可能與移植人MSC后,局部或旁分泌血管生成、抗凋亡及促有絲分裂因子有關,以及與hAMSC和hCMSC向血管細胞分化有關。這些發現可提供心力衰竭新的細胞治療途徑。

2. 5 聽覺系統損傷修復

在聽覺系統,干細胞存在于內耳及螺旋神經節組織,并且能發育成毛細胞和神經元。大多數聽覺損傷病例都是由毛細胞缺失引起的,這種感知細胞存在于內耳并可將聲音轉換成神經信號。但是,由于干細胞在出生后迅速減少而不能再生缺失的細胞。因此,細胞移植就成了修復耳蝸損傷的最佳途徑。體外培養的人羊膜上皮細胞在其細胞膜和細胞核上都表達Cx26 基因(該基因的突變可導致聽覺喪失)及在細胞膜和細胞質中表達Na+ 2K+ 2AT2Pase。在體內,移植入豚鼠耳蝸的羊膜上皮細胞能存活至少3周,并且表達Cx26和Na+ 2K+ 2ATPase,已知這些因子表達于耳蝸的纖維細胞,這表明hAEC具有纖維細胞樣細胞的功能。

2.6  I型糖尿病治療

胰島素形成細胞對于治療1型糖尿病而言,整個胰腺或胰島移植可避免2次并發癥,也可控制血糖水平,但移植材料的短缺仍然是個大問題。研究發現,在體外用煙酰胺刺激培養的人羊膜上皮細胞后可表達胰島素mRNA;體內試驗中,移植hAEC7周后可使鏈脲酶素誘導的糖尿病小鼠模型體內的血糖濃度正常。在移植hAEC后,血糖濃度正?;奶悄虿⌒∈笾?,有20%的小鼠在移植后6周出現高血糖癥狀,這可能與移植細胞的半衰期有關。雖然存在問題,但應用hAEC移植治療糖尿病仍然值得期待。

2. 7 軟骨細胞

hAMC可表達成骨相關基因,如SOX29、SOX25、SOX26、骨形態發生蛋白BMP22 和24 以及BMP的受體;將hAMC與BMP22共同移植入小鼠的無軟骨組織或與膠原支架一起植入生長缺陷的兔骨中,均可出現形態的改變和2型膠原沉積,說明hAMC具有軟骨分化潛能,可作為軟骨疾病及損傷治療的新材料。

羊膜來源細胞具有干細胞特征,可分化為多種組織細胞,使其更適用于組織工程的細胞來源,是組織再生工程中很有潛力的材料來源;羊膜上皮細胞和間質細胞的分離純化技術日漸成熟,為今后大規模的應用奠定了基礎。因此,羊膜及羊膜來源細胞的應用將具有廣闊的前景。在臨床應用中,如何獲得并保存個體羊膜細胞以備將來應用,采取怎樣的保存方法才能盡可能地保持其完整性及細胞活性等問題,仍需要進一步的研究來解決。

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